Около 1328 года родители Преподобного Сергия переселились из Ростова в Радонеж. Когда их старшие сыновья женились, Кирилл и Мария незадолго до смерти приняли схиму в Хотьковском монастыре Покрова Пресвятой Богородицы, неподалеку от Радонежа. Впоследствии овдовевший старший брат Стефан также принял иночество в этом монастыре. Похоронив родителей, Варфоломей вместе с братом Стефаном удалился для пустынножительства в лес (в 12 верстах от Радонежа). Сначала они поставили келлию, а потом небольшую церковь, и, с благословения митрополита Феогноста, она была освящена во Имя Пресвятой Троицы. Но вскоре, не выдержав трудностей жизни в пустынном месте, Стефан оставил брата и перешел в Московский Богоявленский монастырь (где сблизился с иноком Алексием, впоследствии митрополитом Московским, память 12 февраля).
Варфоломей же 7 октября 1337 года принял пострижение в монашество от игумена Митрофана с именем святого мученика Сергия (память 7 октября) и положил начало новому жительству во славу Живоначальной Троицы. Претерпевая искушения и страхования бесовские, Преподобный восходил от силы в силу. Постепенно он стал известен другим инокам, искавшим его руководства. Преподобный Сергий всех принимал с любовью, и вскоре в маленькой обители составилось братство из двенадцати иноков. Их опытный духовный наставник отличался редким трудолюбием. Своими руками он построил несколько келлий, носил воду, рубил дрова, выпекал хлеб, шил одежду, готовил пищу для братии и смиренно выполнял другие работы. Тяжелый труд Преподобный Сергий соединил с молитвой, бдением и постом. Братия удивлялась, что при таком суровом подвиге здоровье их наставника не только не ухудшалось, но еще более укреплялось. Не без труда иноки умолили Преподобного Сергия принять игуменство над обителью. В 1354 году епископ Волынский Афанасий посвятил Преподобного во иеромонаха и возвел в сан игумена. По-прежнему в обители строго выполнялись иноческие послушания. С увеличением монастыря росли и его нужды. Нередко иноки питались скудной пищей, но по молитвам Преподобного Сергия неизвестные люди приносили все необходимое.